image
energas.ru

Территория Нефтегаз № 11 2017

Экология

01.11.2017 10:00 Микробиологическая деструкция нефти в почвах Апшеронского полуострова
Исследованы особенности изменения фракционного состава нефти после ее биодеградации различными микроорганизмами в загрязненных почвах нефтяного месторождения Бинагади на Апшеронском полуострове. В лабораторных условиях изучена деструктивная активность некоторых углеводородокисляющих культур и их ассоциаций, выделенных из нефтезагрязненных почв, в отношении углеводородов нефти. Нефтедеструктивную активность исследуемых ассоциаций микроорганизмов оценивали по суммарному показателю определяемой весовым методом убыли нефти и нефтепродуктов в жидкой среде. Фитотоксичность почв оценивалась биотестом с помощью семян пшеницы по соотношению числа проросших и не проросших семян, высоты проростков и длины корней. Проведен сопоставительный анализ результатов изучения особенностей изменения составов сырых нефтей и нефтяных загрязнений, подверженных микробиологической деструкции в жидкой минеральной среде и в почве. Использование метода инфракрасной спектроскопии c преобразованием Фурье позволяет проанализировать особенности изменения химического состава загрязняющей почвы нефти под влиянием микробиологического окисления и предположить переход ее в более глубокую стадию деградации. Полученные данные свидетельствуют о том, что микробиологические процессы способствуют ароматизации и депарафинизации компонентов исследованной нефти. Также было установлено, что под влиянием микробиологических процессов возрастает степень окисленности нефти за счет увеличения содержания карбонилсодержащих соединений. Следует отметить, что в спектрах наблюдаются полосы поглощения, обусловленные образованием соединений с непредельной связью, а также азотсодержащих соединений. На основе полученных экспериментальных данных можно предположить, что исходная нефть переходит в более глубокую стадию деградации.
Ключевые слова: биодеградация, углеводородокисляющий микроорганизм, деградация, нефтепродукт, микрофлора, нефтяное загрязнение.
Ссылка для цитирования: Бабаев Э.Р. Микробиологическая деструкция нефти в почвах Апшеронского полуострова // Территория «НЕФТЕГАЗ». 2017. № 11. С. 64–69.
Открыть PDF


В последние годы наблюдается интенсивное увеличение объема производства нефтепродуктов и расширение диапазона их эксплуатации, что приводит к интенсификации добычи нефти. Огромные масштабы добычи, транспортировки и переработки этих энергоносителей представляют особую экологическую опасность. Отличительной особенностью техногенного воздействия предприятий нефтеперерабатывающего комплекса на окружающую среду является постепенно повышающийся уровень загрязнения почвы, атмосферы, водных объектов, а также подземных вод. Негативное воздействие нефти и нефтепродуктов обусловлено как непосредственной деградацией почвенного покрова на участках разлива нефти, так и воздействием ее компонентов на сопредельные среды, вследствие чего продукты трансформации нефти выявляются в различных объектах биосферы. В процессе трансформации углеводороды нефти могут образовывать токсичные соединения, обладающие канцерогенными свойствами и характеризующиеся стойкостью к микробиологическому расщеплению.

Среди мер, предпринимаемых в целях охраны окружающей среды от нефтяных загрязнений, одним из наиболее перспективных и экологически безопасных является метод биоремедиации почв и акваторий, основанный на способности некоторых микроорганизмов к деструкции нефти и нефтепродуктов [1–4]. При деструкции нефтей, загрязняющих почвы, происходит не просто снижение остаточного их содержания, но и изменение фракционных составов, что обусловлено процессами перераспределения нефти по почвенному профилю. В условиях природного микробиоценоза наблюдается ассимиляция в различной степени разных фракций нефти определенными группами микроорганизмов. Важно знать механизмы и степень окисления различных классов нефтяных углеводородов конкретными родами углеводородокисляющих микроорганизмов.

Целью настоящей работы является исследование физико-химических свойств и химического состава углеводородов нефти, загрязняющей почвы Апшеронского п-ова (месторождение Бинагади) после их биодеградации углеводород-окисляющими микроорганизмами.

 1.png

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Почвы

В работе использовали образцы почв, отобранных из загрязненных территорий, находящихся в непосредственной близости от скважин месторождения Бинагади, а также незагрязненных почв того же месторождения (контроль). Образцы почв отбирались стерильным ножом в стерильную стеклянную посуду. Затем на очищенном спиртом стекле их тщательно перемешивали стерильным фарфоровым шпателем, распределяли тонким слоем и доводили до воздушно-сухого состояния в чистом сухом помещении, не содержащем в воздухе пыли и газов (NH3, HCl).

Величину, характеризующую содержание влаги в почве, определяли по известной методике [5]. Содержание нефтепродуктов в почвах определяли весовым методом после экстракции углеводородов из навески почвы горячим гексаном в аппарате Сокслета [6].

Микробиологические исследования были проведены немедленно после отбора образцов почв.

Фитотоксичность почв оценивалась биотестом с помощью семян пшеницы по соотношению числа проросших и не проросших семян, а также высоты проростков и длин корней [7].

 

Анализы нефтепродуктов, загрязняющих исследуемые образцы почв

Осаждение асфальтенов из экстрактов исходной нефти проводили 40-кратным по объему количеством петролейного эфира, с температурой кипения 40–70 °С. Методом жидкостно-адсорбционной хроматографии на колонке с двойным сорбентом (внизу – оксид алюминия, вверху – силикагель 40/100 мкм (Chemapol, Чехия)) деасфальтенизаты разделяли на фракции, элюированные гексаном, бензолом и смесью «бензол –
этанол» (1:1).

Структурно-групповой состав исследуемых фракций определяли методом фурье-спектроскопии на инфракрасном спектрометре Varian 3600 в диапазоне 4000–400 см-1.

Численность гетеротрофных микроорганизмов в почве определяли методом 10-кратных разведений почвенной суспензии [8] с последующим высевом на поверхность агаризованных сред (мясопептонный агар (МПА) для бактерий и сусло-агар (СА) для грибов и дрожжей) при температуре 28–32 °С.

Колонии бактерий подсчитывали через три, а грибов и дрожжевых – через пять дней. Для определения количества углеводородокисляющих бактерий была использована минеральная среда состава, г/л: KH2PO0 – 0,5; K2HPO4 – 0,5; MgSO4•7H2O – 0,3; FeCl3 – 0,01; NaCl – 0,01; CaCl2 – 0,1; NaNO3 – 2,5; агар-агар – 20; вода дистиллированная – 1 л, рН 7.

В качестве единственного источника углерода в среду вносили 1 г нефти, выделенной из загрязненных почв, или ее гексановую, бензольную и этанол-бензольную фракции.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Учитывая макро- и микрогетерогенность почв по всем свойствам, и в первую очередь по микробиологическим, было проведено исследование образцов серо-бурых почв, отобранных с нефтедобывающего региона Бинагади в непосредственной близости от скважин (на расстоянии 0–5, 0–10, 0–15 и 0–20 м [6, 9]). С образцами почв был проведен ряд физико-химических и микробиологических анализов по таким параметрам, как влажность, рН, содержание нефти и общее количество микроорганизмов, в том числе бактерий, грибов и дрожжевых.

Результаты микробиологического анализа (табл. 1) показали, что общее содержание микрофлоры в нефтезагрязненных почвах ниже, чем при отсутствии нефтезагрязнений.

Микрофлора в основном представлена различными видами бактерий, дрожжевая и грибковая микрофлора очень малочисленна. Такое состояние характерно для почв, длительное время подвергавшихся нефтезагрязнениям. В почвах, не сильно загрязненных нефтью, обитает большее количество углеводородокисляющих микроорганизмов. Очевидно, они достаточно адаптированы к данной среде и используют нефтепродукты в качестве источника питания. На количестве микроорганизмов, обитающих близко (5 м) к источнику загрязнения, сказывается отрицательное влияние нефтезагрязнений, имеющихся в этой почве в относительно большом количестве.

Из нефтезагрязненных почв было выделено 17 штаммов микроорганизмов, способных перерабатывать выделенную из этих же почв нефть и ее некоторые компоненты (гексановую, бензольную и спиртобензольную фракции). Отобранные штаммы культивировали в жидкой минеральной питательной среде с перечисленными нефтепродуктами (1 г) на качалке (150 об/мин) при температуре 32 °С в течение 7 сут. В качестве конт-
роля использовали колбы со средой и нефтепродуктами, без инокулирования. Степень деструкции нефти определяли весовым методом, биомассу предварительно отмывали гексаном (табл. 2). Как видно из табл. 2, исследованные культуры микроорганизмов различаются по активности потребления компонентов нефти и нефтепродуктов. Характер потребления нефти различался у разных штаммов как количественно, так и качественно.

На разработанных оптимальных составах специфических синтетических питательных сред, обеспечивающих максимальную активность микроорганизмов, выделены и культивированы микроорганизмы, способные ассимилировать компоненты нефти Бинагадинского нефтеносного района.

Проведены работы по определению деструктивной активности отобранных культур по отношению к углеводородным фракциям нефти, полученным адсорбционным разделением выделенных из почв нефтезагрязнений. В опытах использованы следующие фракции нефти: гексановая (содержит нафтенопарафиновые и ароматические углеводороды), бензольная (полициклические, ароматические, бензольные смолы), этанол-бензольные (нафтеновые кислоты, этанол-бензольные смолы).

Нефтедеструктивную активность исследуемых ассоциаций микроорганизмов оценивали по суммарному показателю убыли нефти и нефтепродуктов в
жидкой среде, определяемую весовым методом. Характер потребления фракций нефти различался у разных штаммов как количественно, так и качественно. Поэтому можно полагать, что при биодеградации нефти происходит избирательное потребление компонентов нефти микроорганизмами.

Степень деструкции выделенной из загрязненных почв нефти достигала 50–70 %: у культур S11 – 50 %, S1 – 60 %, S7 – 65 %, S2 – 70 % (табл. 2).

Известно, что смолистые фракции являются наиболее труднодоступными субстратами для биодеструкции. Утилизация бензольных смесей происходила наиболее активно при культивации культур В2 и В10 и составила 15 и 20 %, соответственно. Этанол-бензольные смолы являются высококонденсированной фракцией исследуемых нефтей и труднодоступным субстратом при культивировании микроорганизмов. Самой активной культурой по утилизации этих углеводородов оказалась В8 (20 %).

На основании результатов эксперимента установлено, что для повышения эффективности биодеградации целесообразно использовать смешанные культуры, состоящие из двух и более микроорганизмов. Четких критериев составления искусственных ассоциаций нефтедеструкторов до настоящего времени не выработано, и в состав биопрепаратов включают штаммы, отобранные по принципу их совместимости и высокой нефтеразлагающей активности. Автором проведен анализ активности отдельных штаммов микроорганизмов и их сочетаний в отношении разложения нефти и нефтепродуктов для отбора наиболее перспективных микробных ассоциаций, способных к биоремедиации почв, загрязненных нефтью. Были испытаны ассоциации, состоящие из разного числа штаммов. Из данных табл. 2 следует, что из ассоциаций, состоящих из двух штаммов, наиболее эффективными деструкторами нефти оказались комбинации № 20 (B2+B7) – 60 % и № 21 (B2+B12) – 70 %. Замена в эффективной (70 %) ассоциации № 21 штаммов B12 на B1 ведет к понижению степени деструкции (35 %) этой ассоциации (В1+В2), что свидетельствует о возможном антогонизме этих культур.

Добавление к парам штаммов (В7+В10) дополнительного штамма В2 повысило деструктивную активность до 53 % (на 23 %), а добавление к паре (В2+В12) дополнительного штамма В16 снижает деструктивную активность ассоциации (В2+В12+В16) с 70 до 45 %, что, очевидно, также связано с наличием антагонизма между культурами. В 4-компонентных ассоциациях эффективной оказалась смесь № 26 (В1+В7+В10+В12) –
60%-я деструкция.

При исследовании деструктивной активности ассоциаций микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв, изучалось влияние состава минеральных питательных сред на деструктивную активность исследуемых микроорганизмов.

Исследованы и выбраны рациональные составы питательных сред, повышающие деструктивную эффективность отобранных ассоциаций микроорганизмов и способствующие более эффективной деструкции нефтезагрязнений изучаемых почв. Для ассоциаций микроорганизмов, выделенных из почв месторождения Бинагади, изучены нижеследующие минеральные питательные среды:

• среда № 1 (г/л): KNO3 – 2,0; K2HPO4 – 0,5; Na2HPO4 – 0,4; MgSO4 – 0,4; CaCl2 – 0,01; MgSO4•7H2O – 0,01 (pH – 7,0);

• среда № 2 (г/л): NH4Cl – 2,5; CaCl2 – 0,01; MnCl2•4H2O – 0,02; NaH2PO4 – 1,0; KH2PO4 – 1,0; MgSO4 – 0,2; FeSO4•7H2O – 0,01; NaCl – 5,0 (pH – 7,0...7,2);

• среда № 3 (г/л): K2HPO4 – 0,5; KH2PO4 – 0,5; MgSO4 – 0,3; NaCl – 0,1; FeCl3 – 0,01; NaNO3 – 2,5; CaCl2 – 0,1.

Из результатов исследования (табл. 3, рисунок) следует, что изучавшиеся штаммы культур лучше развиваются в минеральной среде № 3.

Следует отметить, что при деструкции нефти, выделенной из загрязненных почв, происходило не просто снижение остаточного ее содержания, но и изменение ее фракционного состава. В табл. 4 представлены данные исследуемой нефти после ее деструкции. В качестве контроля взята исходная нефть, выделенная из почв и используемая в качестве субстрата при культивировании. Также исследованы ее гексановые, бензольные и спиртобензольные фракции. Кроме того, изучен состав нефти после ее биодеградации в жидкой среде (колбе) и в почве (вегетативный опыт) (табл. 4).

Методом ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье изучен углеводородный состав нефтей месторождения Бинагади: нативной (1), выделенной из нефтезагрязненных почв (2), подверженной биодеградации в жидкой среде (3) и под влиянием вегетативного эксперимента (4).

Выделены спектральные коэффициенты, характеризующие групповой состав компонентов нефти.

Спектральные коэффициенты, характеризующие химическую структуру соединений нефти, определяли как отношение интегральных интенсивностей соответствующих полос поглощения: алифатических (720–723, 1377–1383 и 1457–1463 см–1) и ароматических структур (1608–1618 см–1), карбоксильных групп в кислотах и эфирах (1700–1710, 1730–1740 см-1), фрагментов, содержащих С=С, С=N, C–N=O и NH-связи (1637–1640 см-1); сульфоксидных (1024–1038 см-1), конденсированных полиметиленовых (965–974 см-1) и метиленовых групп в боковых цепях (743–753 см-1).

Использовали следующие коэффициенты С1 = S745/S1460; C2 = S974/S1460; C3 = S1030/S1460; C4 = S1380/S1460; C5 = S1600/S720 (ароматичности); C6 = S1640/S1460; C7 = S1700/S1460; C8 = S1740/S1460; C9 = S1640/S1460; C10 = S720 + S1380/S1600 (алифатичности) и С11 = S610/S1460 (осерненности).

Интегральное поглощение углеводородов в области ≈3000 см-1 позволяет судить об особенностях изменения химического состава загрязняющей почву нефти под влиянием микробиологического окисления. Увеличение поглощения в области 1650–1800 см-1 свидетельствует об увеличении степени окисляемости нефтепродуктов микроорганизмами (содержание С=О-структуры). Поглощение в области 720–1380 см-1 свидетельствует об изменении алифатичности (поскольку увеличение разветвленности свидетельствует о наличии процессов биодеградации, то, соответственно, уменьшается доля парафиновых структур). Информативна область 1800–1600 см-1, где определяются колебания С=С, С=О, позволяющие идентифицировать наличие непредельных и карбонилсодержащих соединений (альдегиды, кетоны и кислоты). Это также свидетельствует о протекающих процессах биологического окисления исследуемых нефтепродуктов.

Из приведенных спектральных данных следует, что микробиологические процессы способствуют ароматизации и депарафинизации компонентов исследованной нефти и при этом также увеличивается степень ее окисленности за счет увеличения содержания карбонилсодержащих соединений. Следует отметить, что в спектрах наблюдаются также полосы поглощения, ответственные за образование соединений с непредельной связью и азотсодержащих соединений.

Можно предположить, что исходная нефть переходит в более глубокую стадию деградации.


Таблица 1. Характеристика образцов почв, отобранных на различных расстояниях от источника загрязнения

Table 1. The characteristics of soil samples collected at different distances from the source of pollution

Образец почвы

The sample of soil

Влажность, % 

Humidity, %

рН

Содержание нефти, %

The oil content, %

 Общее количество микроорганизмов в 1 г сухой почвы

The total number of microorganisms in 1 g of dry soil 

Полевая

Field

Гигроскопическая Hygroscopic

Общие бактерии

Common bacteria

Углеводородокисляющие бактерии

Hydrocarbon-oxidizing
bacteria

Грибы

Fungi

Дрожжи

Yeast fungi

5

11

1,5

6,0

11,2

58•105

14•104

17•104

1•103

10

5

0,6

6,2

7,7

48•105

12•104

12•104

7•103

15

3

0,3

6,4

3,3

26•105

10•104

11•104

8•103

20

5

0,41

6,8

1,5

24•105

9•104

8•104

11•103

Контроль

Control

3

0,35

7,2

-

11•107

9•104

32•104

12•103

Таблица 2. Нефтедеструктивная активность микроорганизмов

Table 2. The oil-degrading activity of microorganisms

Культура 

Culture

Степень деструкции, % 

Stage of biodegradation, %

Кол-во сухой биомассы 

Amount of dry biomass

рН

До опыта 

Before test

После опыта 

After test

1

B1

60

100

7,0

6,5

2

B2

70

70

7,0

6,5

3

B3

25

50

7,0

7,0

4

B4

25

60

7,0

7,0

5

B5

28

75

7,0

6,5

6

B6

20

30

7,0

7,5

7

B7

65

350

7,0

6,5

8

B8

35

150

7,0

6,0

9

B9

10

7,0

7,0

10

B10

40

100

7,0

6,8

11

B11

50

150

7,0

6,5

12

B12

42

70

7,0

6,5

13

B13

10

0

7,0

7,0

14

B14

18

50

7,0

7,0

15

B15

15

40

7,0

7,0

16

B16

25

60

7,0

7,0

17

B17

20

50

7,0

7,0

18

B1+B2

35

100

7,0

6,6

19

B7+B10

30

100

7,0

7,7

20

B2+B7

60

350

7,0

6,5

21

B2+B12

70

370

7,0

6,0

22

B7+B10

30

75

7,0

6,0

23

B7+B2+B10

53

250

7,0

6,3

24

B2+B7+B12

55

350

7,0

6,5

25

B2+B12+B16

45

300

7,0

6,5

26

B1+B7+B10+B12

60

200

7,0

6,3

27

B1+B7+B11+B16

58

350

7,0

6,0

28

B12+B7+B10+B11

45

280

7,0

6,2

29

B12+B11+B12+B16 

40

250

7,0

6,5


Таблица 3. Изучение углеводородокисляющих способностей микробных ассоциаций в жидких средах

Table 3. The investigation of hydrocarbon-oxidizing abilities of microbial associations in liquid environments

Питательные среды, № 

Nutrient mediums, No.

Смесь культур, 2 мл 

Culture mix, 2 ml

Кол-во нефти, г 

Amount of oil, g

Кол-во остаточной нефти, г 

Amount of residual oil, g

Кол-во сухой биомассы, мг 

Amount of dry biomass, mg

Степень деструкции,% 

Stage of biodegradation, %

рН

До опыта 

Before test

После
опыта 

After test

1

В2+В7+В12

1

0,43

350

45

7,0

6,5

В2+В12+В16

0,55

300

55

7,0

6,5

В1+В2+В10+В12

0,43

350

55

7,0

6,0

В1+В7+В11+В16

0,42

400

58

7,0

6,0

В7+В11+В10+В12 

0,35

400

45

7,0

6,2

В2+В11+В12+В16 

0,60

250

40

7,0

6,5

2

В2+В7+В12

1

0,30

400

70

7,0

6,5

В2+В12+В16

0,45

325

55

7,0

7,2

В1+В2+В10+В12

0,40

200

60

7,0

6,0

В1+В7+В11+В16

0,45

320

55

7,0

6,0

В2+В11+В12+В16 

0,62

350

38

7,0

6,5

В2+В11+В12+В16 

0,63

100

27

7,0

6,5

3

В2+В7+В12

1

0,25

470

75

7,0

7,5

В2+В12+В16

0,56

350

50

7,0

6,0

В1+В2+В10+В12

0,20

500

80

7,0

6,0

В1+В7+В11+В16

0,40

370

60

7,0

6,5

В2+В11+В12+В16 

0,55

320

45

7,0

6,5

В7+В10+В11+В12 

0,60

300

40

7,0

6,5

Таблица 4. Характеристика нефтепродуктов до и после микробного окисления

Table 4. Characteristics of oil products before and after microbial oxidation

Объект исследования 

Subject of research

Плотность, г/см3 

Density, g/sm3

Фракции, % 

Fractions, % 

Гексановая 

Hexane

Бензольная 

Benzene

Спиртобензольная 

Alcohol-benzene

1

Нефть (исходная) 

Oil (original)

0,9027

34

n201,4930D

17

n201,5145D

6,2

2

Нефтяное загрязнение 

Oil pollution

1,0695

28

n201,4935D

14,2

n201,5078D

9,8

3

Нефтяное загрязнение после биодеградации (в жидкости) 

Oil pollution after biodegradation (in fluids)

0,9943

24

n201,4886D

12

11,6

4

Нефтяное загрязнение после биодеградации 

Oil pollution after biodegradation

0,9867

n201,4907D

11,7

13,8

 




← Назад к списку


im - научные статьи.