image
energas.ru

Газовая промышленность № 05 2018

Экология

01.05.2018 11:00 РАЗРАБОТКА БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ РИЗОСФЕРНЫХ И АЗОТФИКСИРУЮЩИХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ РЕКУЛЬТИВАЦИИ И ОЧИСТКИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ И НАРУШЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ
Описан опыт разработки биопрепарата на основе ризосферных и азотфиксирующих микроорганизмов для применения при рекультивации и очистке загрязненных и нарушенных территорий объектов нефтегазового комплекса. Экспериментально доказано преимущество использования консорциума штаммов перед однокомпонентными биопрепаратами. Для оценки воздействия культур микроорганизмов на вегетативные процессы растений, определения их оптимальных соотношений в растворах и зависимости от температурных факторов поставлены эксперименты с двухкомпонентными растворами штаммов. Рассмотрены три соотношения культур: 1:2, 2:1 и 1:1. Эффективность каждого раствора определялась отдельно. В целях моделирования потенциально возможных климатических условий применения биопрепарата на объектах нефтегазового комплекса исследования двухкомпонентных растворов проводились при трех температурных режимах: 10, 25 и 35 °C. Приведены результаты лабораторных испытаний разработанного биопрепарата. В ходе лабораторных экспериментов выделены штаммы, охарактеризованные достаточной деструктивной активностью к углеводородам, что открывает перспективы их применения в ходе биологического этапа рекультивации загрязненных земель на объектах нефтегазового комплекса. Проведенные эксперименты подтвердили способность выделенных штаммов развиваться при температуре от 7 °C и возможность их применения при работах по ликвидации последствий углеводородного загрязнения почвы в регионах с коротким вегетационным периодом. Показано, что использование биопрепарата на основе двухкомпонентного раствора позволяет достичь снижения концентрации углеводородного загрязнения на 36 % за 30 сут. Поставленные эксперименты показали положительную динамику воздействия биопрепарата на почву, что дает основание для апробации разработанного биопрепарата в полевых условиях непосредственно на объектах нефтегазового комплекса в различных климатических зонах Российской Федерации
Ключевые слова: РЕКУЛЬТИВАЦИЯ, БИОПРЕПАРАТ, ALCALIGENES FAECALIS, MICROBACTERIUM TESTACEUM, УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, ОЧИСТКА ЗЕМЕЛЬ, ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА, КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ, ЛАБОРАТОРНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ, БИОРЕМЕДИАЦИЯ.
Открыть PDF


В основе биовосстановления нарушенных и загрязненных углеводородами почв лежит процесс стимуляции природных процессов самоочистки почвы [1]. Интенсифицировать процесс восстановления можно двумя способами: внесением биопрепаратов, содержащих штаммы микроорганизмов-деструкторов, и активацией нативной микрофлоры [2].

Известно, что микробиоценоз страдает от токсического шока, вызванного поступлением больших количеств загрязнителя, и численность микроорганизмов (МО) сокращается [3]. Деградация углеводородов в окружающей среде начинается микроорганизмами-деструкторами, поэтому необходима их высокая концентрация [4]. Таким образом, внесение дополнительного количества углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) ускоряет начало процесса очистки загрязненных земель.

Применение технологий биологической очистки оправданно при низких концентрациях загрязнителя, когда прочие методы уже не работают [5]. Среди преимуществ биологических методов очистки в первую очередь стоит отметить их безопасность, экологическую чистоту и минимальное нарушение физического и химического состава очищаемых объектов [6].

 

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования показывают преимущество применения для разложения загрязненных субстратов ассоциаций УОМ перед отдельно взятыми штаммами [5]. Этим объясняется объединение нескольких компонентов в одном биопрепарате либо применение их в комплексе друг с другом. Исходя из этого, в препарате для рекультивации нарушенных и загрязненных земель были подобраны и объединены два эффективных штамма МО.

В период с 2009 по 2016 г. в ходе эколого-технологических экспедиций сотрудниками лаборатории биотехнологических исследований ООО «Газпром ВНИИГАЗ» была собрана уникальная коллекция штаммов УОМ широкого спектра действия, разработана схема по выделению, отбору и их комп- лексному изучению. Наиболее эффективные штаммы были идентифицированы как Microbacterium testaceum и Alcaligenes faecalis и депонированы в коллекции ФГБУ «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» с присвоением индивидуальных номеров Ас-1998 и В-1212416 соответственно.

Специалистами ОАО «ГосНИИсинтезбелок» определены области применения штаммов: стимуляция роста растений в процессе фиторемедиации почв при очистке углеводородного загрязнения для Alcaligenes faecalis; повышение содержания азота в почве за счет фиксации атмосферного азота при рекультивации для Microbacterium testaceum.

При испытаниях поставлена задача моделирования применения биопрепарата в условиях, максимально приближенных к различным природно-климатическим условиям, и апробация вариантов его использования.

Испытания разделены на два этапа. Во-первых, испытания биопрепарата при различных температурных условиях. Эксперимент проводился на модельных образцах почвы в лабораторных условиях, в том числе с искусственным загрязнением почвы нефтепродуктами. Во-вторых, натурные испытания биопрепарата в условиях открытого грунта, так называемый мелкоделяночный опыт, с искусственным загрязнением некоторых делянок.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Для исследования отобрано 13 различных композиций (вариантов) биопрепарата, свойства которых были апробированы экспериментально в условиях лаборатории и на восьми опытных делянках в максимально приближенных к полевым условиях открытого грунта (табл. 1, 2).

Количество экспериментов обусловлено поиском оптимальных соотношений культур и концентраций биопрепарата для возможности его применения в различных природных условиях и климатических поясах. Эффективность биоремедиации загрязненных земель зависит как от количества УОМ, так и от концентрации раствора биопрепарата. Малонасыщенная суспензия способна дать только разовый результат, без ожидаемого пролонгированного действия. В свою очередь, перенасыщенная суспензия помимо необоснованных затрат может на начальном этапе привести к результатам даже лучше прогнозируемых, но впоследствии станет угнетать и истощать растения.

В экспериментах использовали один для всех состав травосмеси, рекомендованный НАО «Сибирский научно-аналитический центр» (табл. 3).

Этап «А»: постановка эксперимента в лабораторных условиях. На этапе «А» для испытаний биопрепарата взяли верхний (10– 20 см) слой супесчаной почвы, отобранный в естественных условиях средней полосы России.

Перед посевом образцы почвы загрязняли дизельным топливом (ДТ) из расчета 2 % от объема почвы. Полезная площадь почвы засеваемой модели составила 0,0085 м2. Травосмесь засевалась исходя из количества 150 кг/га.

Два контейнера обработали сус- пензиями Alcaligenes faecalis с концентрацией культуры 1 и 2 % соответственно. На 10-е сутки почва обрабатывалась повторно той же суспензией Alcaligenes faecalis, что и в момент залужения травосмеси. Этот вариант наблюдался при температуре окружающей среды (25 °C) в течение всего эксперимента.

Аналогичная схема выполнялась и для суспензии Microbacterium testaceum с концентрациями 1 и 2 %.

Для оценки воздействия культур МО на вегетативные процессы растений, определения их оптимальных соотношений в растворах и зависимости от температурных факторов поставлены эксперименты с двухкомпонентными растворами – консорциумами штаммов. Рассмотрены три соотношения культур МО: 1:2, 2:1 и 1:1. Эффективность каждого раствора определялась отдельно, по принципу эксперимента с однокомпонентыми растворами.

Исследования двухкомпонентных растворов проводились при трех температурных режимах: 10, 25 и 35 °C. Моделировались потенциально возможные климатические условия применения биопрепарата – объекты нефтегазового комплекса. С этой целью опытные образцы помещались в сухожаровой шкаф и холодильник, где поддерживалась соответствующая температура (10 и 35 °C) в течение всего эксперимента. Перед высевом травосмеси, как и в варианте с однокомпонентными растворами, в виде загрязнителя использовали ДТ в тех же количествах – 2 % от объема образца почвы. Повторная обработка двухкомпонентными растворами биопрепаратов также производилась спустя 10 сут после посева.

Увлажнение всех образцов проводили по мере необходимости водопроводной водой.

В ходе эксперимента контролировали концентрацию углеводородов в опытных образцах почвы и динамику ее очистки (рис. 1).

Лучшие результаты по очистке почвы от углеводородных загрязнений получены в эксперименте № 6 – при 35 °C. За 30 сут в этом образце степень очистки достигла 36 % (см. рис. 1а). Та же тенденция просматривается и в экспериментах с моделями при других температурных режимах (см. рис. 1б, в).

Очистка образцов № 1–2 в среднем составила от 12–15 до 27– 30 % за 30 сут.

Низкий результат очистки почвы в образцах № 3 и 4 говорит о неэффективности применения в растворе одних лишь азотфиксирующих Microbacterium testaceum в работах по рекультивации загрязненных земель на объектах нефтегазового комплекса. Уровень очистки в пределах 5–6 %, по мнению авторов, достигнут за счет испарения легких фракций углеводородов и вряд ли может быть следствием работы Microbacterium testaceum.

Этап «Б»: постановка эксперимента в условиях открытого грунта. Исследовалась возможность применения биопрепарата на открытых участках почвы на территории опытного участка лаборатории в целях имитации использования биопрепарата при работах по рекультивации загрязненных и нарушенных земель. Было разбито девять одинаковых опытных делянок площадью по 1 м2 каждая.

В ходе исследований апробированы восемь композиций растворов биопрепарата. Испытания проводились по схеме, идентичной этапу «А», за исключением вариантов с изменением температурного режима. Наблюдения за делянками, открытыми воздействию естественных внешних факторов, позволили более детально подобрать и определить методы рекультивации в условиях, максимально приближенных к полевым.

Для моделирования загрязнения, так же как и на этапе «А», использовали ДТ в объеме 2 %. Травосмесь высевалась в тех же количествах, что и на лабораторных испытаниях: из расчета 15 кг/га, т. е. по 15 г/м2. Залужение семян травосмеси производилось на глубину 1,5–2,0 см. После этого засеянные делянки обработали рабочими суспензиями биопрепарата в соответствии со схемой, представленной в табл. 4.

Таким образом, две делянки были обработаны 2%-ными однокомпонентными растворами биопрепарата на основе Alcaligenes faecalis и Microbacterium testaceum соответственно, а шесть делянок – двухкомпонентными растворами Alcaligenes faecalis и Microbacterium testaceum с разными соотношениями культур (2%-ные концентрации) – 1:2, 2:1 и 1:1 соответственно, в три из которых был внесен загрязнитель в виде ДТ. Контрольная делянка биопрепаратом не обрабатывалась. Увлажнение производили по мере необходимости водопроводной водой, соответствующей температуре окружающей среды, поддерживая влажность делянок на уровне 55–60 %.

Лучшая динамика наблюдалась в течение первых 30 сут – периода активного роста растений в мае – июне. Результаты подтверж- дают эффективность и необходимость применения растворов биопрепарата именно в работах по восстановлению нарушенных и загрязненных земель.

Результаты эксперимента на опытных делянках приведены в табл. 5, отражено преимущество двухкомпонентных растворов. Это свидетельствует о симбиозе Alcaligenes faecalis и Microbacterium testaceum и правильно подобранных соотношениях культур.

Таким образом, в ходе лабораторных экспериментов выделенные штаммы охарактеризованы достаточной деструктивной активностью к углеводородам, что открывает перспективы их применения в ходе биологического этапа рекультивации загрязненных земель на объектах нефтегазового комплекса. Проведенные эксперименты подтвердили способность выделенных штаммов развиваться при температуре от 7 °С и возможность их применения при работах по ликвидации последствий углеводородных загрязнений в регионах с коротким вегетационным периодом.

 

ВЫВОДЫ

В результате проведенных исследований установлено, что наилучший эффект может быть достигнут при применении двухкомпонентной суспензии микроорганизмов Alcaligenes faecalis и Microbacterium testaceum в соотношении 1:1. Худший результат получен при использовании однокомпонентных растворов биопрепарата. Показано, что использование биопрепарата на основе двухкомпонентного раствора позволяет достичь снижения концентрации углеводородного загрязнения на 36 % за 30 сут.

Проведенные испытания подтвердили преимущество двухкомпонентных растворов биопрепарата при их использовании в работах по рекультивации и очистке нарушенных и загрязненных земель. Поставленные эксперименты показали положительную динамику воздействия биопрепарата на почву, что дает основание для апробации разработанного биопрепарата в полевых условиях непосредственно на объектах нефтегазового комплекса в различных климатических зонах РФ.


Таблица 1. Схема проведения экспериментов в лабораторных условиях; лаборатория ООО «Газпром ВНИИГАЗ» Table 1. Scheme of experiments in the laboratory; Laboratory of Gazprom VNIIGAZ LLC

Состав биопрепарата

Composition of the biological preparation

Концентрация, %

Concentration, %

Соотношение компонентов раствора

Ratio of the solution components

Температура, °C

Temperature, °C

Обработка раствором

Solution treatment

Углеводородный загрязнитель

Hydrocarbon contaminant

замачивание в растворе

soaking

в момент посева

at seeding

повторная, через 10–15 сут

repeated, after 10–15 days

Alcaligenes faecalis

1

25

+

+

2

25

Microbacterium testaceum

1

25

+

+

2

25

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum

2

1/1

10

+

+

+

2

25

+

+

+

2

35

+

+

+

2

2/1

10

+

+

2

25

+

+

2

35

+

+

2

1/2

10

+

+

2

25

+

+

2

35

+

+

 

Таблица 2. Схема проведения экспериментов в условиях открытого грунта на опытном участке лаборатории ООО «Газпром ВНИИГАЗ» Table 2. Scheme of experiments in open ground conditions in the pilot site of the laboratory of Gazprom VNIIGAZ LLC

Состав биопрепарата

Composition of the biological preparation

Концентрация, %

Concentration, %

Соотношение компонентов раствора

Ratio of the solution components

Температура, °C

Temperature, °C

Обработка раствором 

Solution treatment

Углеводородный загрязнитель

Hydrocarbon contaminant

замачивание в растворе

soaking

в момент посева

at seeding

повторная, через 10–15 сут

repeated, after 10–15 days

Alcaligenes faecalis

2

Окружающей среды

Environment

+

+

Microbacterium testaceum

2

+

+

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum

2

1/1

+

+

2

1/2

+

+

2

2/1

+

+

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum

2

1/1

+

+

+

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum

2

1/2

+

+

+

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum

2

2/1

+

+

+

 

Таблица 3. Состав травосмеси для посева Table 3. Composition of grass mixture for seeding

Виды трав 

Grass types

Содержание, % 

Content, %

Всхожесть, % 

Germinating ability, %

Тимофеевка луговая 

Timothy grass

23

Не менее 90 

Not less than 90

Кострец безостый 

Awnless brome

23

Овсяница красная 

Red fescue

23

Овсяница луговая 

Meadow fescue

23

Мятлик 

Snow grass

8

 

Таблица 4. Схема натурных испытаний (этап «Б») Table 4. Scheme of field tests (stage B)

№ эксперимента

No. of experiment

Биопрепарат

Biological preparation

Концентрация, %

Concentration, %

ДТ 2 %

Diesel fuel 2 %

Обработка рабочей суспензией биопрепарата

Treatment by the biological preparation suspension

Температура, °C

Temperature, °C

первичная

primary

повторная

repeated

1

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 1:2

2

+

+

Окружающей среды

Environment

2

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 1:1

2

+

+

3

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 2:1

2

+

+

4

Microbacterium testaceum

2

+

+

5

Alcaligenes faecalis

2

+

+

6

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 1:2

2

+

+

+

7

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 1:1

2

+

+

+

8

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 2:1

2

+

+

+

9

Контроль

Control

 

Таблица 5. Показатели растительного покрова опытных делянок Table 5. Indicators of the vegetation cover of the experimental plots

Параметры

Indicators

№ эксперимента 

No. of experiment

9

4

5

1

2

3

7

6

8

Контроль

Control

Microbacterium testaceum 2 %

Alcaligenes faecalis 2 %

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 1:2

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 2:1

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 1:1

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 1:2

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 2:1

Alcaligenes faecalis/Microbacterium testaceum 1:1

Проективное покрытие, %

Projective cover, %

62

70

70

90

92

87

80

80

75

Жизненное состояние

Viable state

Незначительно ослабленные растения с несколько угнетенными надземными побегами и в меру развитой корневой системой

Slightly weakened plants with a few suppressed above-ground sprouts and moderately developed root system

Жизнеспособные растения с хорошо развитыми надземными побегами и корневой системой

Viable plants with well-developed above-ground sprouts and root system

Ослабленные растения со слабо развитой надземной системой, глубина корней менее 10 см, имеются признаки усыхания листовых пластинок

Weakened plants with a poorly developed above-ground system, root depths is less than 10 cm, there are signs of drying of leaf blades

Фенологическая фаза

Phenological phase

Вегетация (кущение и развитие розетки)

Vegetation (tillering and development of the rosette)

Высота надземной части, см

Herb height, cm

27,5

28,0

27,5

29,5

30,0

30,0

27,0

28,0

26,5

Масса вегетативных надземных побегов на 1 м2 (сырая масса), г/м2

Weight of vegetative above-ground sprouts per 1 m2 (wet weight), g/m2

400

600

500

670

680

650

400

520

300

Масса корневой системы на 1 м2 (сырая масса), г/м2

Weight of the root system per 1 m2 (wet weight), g/m2

370

520

450

560

540

550

230

400

90

 




← Назад к списку